一、单细胞Perturb-seq技术介绍
单细胞Perturb-seq（scPerturb-seq）是一种将高通量CRISPR基因扰动与单细胞转录组测序（scRNA-seq）相结合的革命性技术，能够在单细胞分辨率下系统性解析基因功能、调控网络及疾病机制。
1. 技术原理：通过CRISPR-Cas9系统（敲除/激活/抑制）对目标基因进行大规模扰动，并利用单细胞测序技术全面捕获每个细胞的转录组变化，从而精准建立“基因扰动→分子表型→生物学功能”的关联图谱。
2. 创新点：
单细胞分辨率：揭示同一扰动下不同细胞亚群的异质性响应（如1%耐药细胞的独特通路）
无偏性筛选：无需预设假设，一次性解析数千基因对细胞状态、信号通路及调控网络的影响
动态机制解析：结合拟时序分析（Pseudotime），追踪基因扰动如何影响细胞命运决策（如分化、转分化）
二、实验流程
1. 实验设计与前期准备
1.1研究目标确认：明确科学问题（如癌症耐药机制、神经发育调控等），确定研究规模（全基因组筛选vs通路特异性筛选）
1.2 sgRNA文库设计：
1.3 细胞模型选择：体外：细胞系（需验证编辑效率）、原代细胞、类器官； 体内：AAV递送（需测试组织转染效率）
2. CRISPR文库构建与递送
3. 单细胞制备与捕获
3.1 细胞准备：消化成单细胞悬液（活率>90%）；细胞浓度调整至700-1,200细胞/μL
3.2 微流控分选：平台选择：10x Genomics Chromium X/BD Rhapsody；捕获目标：≥10,000细胞/样本（建议技术重复）
4. 高通量测序
4.1 测序策略：转录组：双端150bp，推荐深度50,000 reads/cell； sgRNA：单端50bp，推荐深度500 reads/cell
4.2 平台选择： Illumina NovaSeq（高通量）； MGI DNBSEQ-T7（成本优势）
5. 生物信息学分析
5.1 原始数据处理；
5.2 序列比对
5.3 单细胞数据分析：细胞过滤（≥500基因/cell）、批次校正（Harmony/Seurat）、扰动关联（MUSIC/SCEPTRE算法）
5.4 高级分析：差异表达分析（MAST/DESeq2）、调控网络构建（SCENIC）、拟时序分析（Monocle3）
三、图博技术优势
1. 采用超低丰度基因捕获技术，可稳定检测占比<0.5%的稀有细胞亚群，避免传统方法因信号稀释导致的漏检问题。
2. 基于自动化液滴微流控系统（10x Genomics/BD Rhapsody），单次实验可分析>10,000个细胞，结合高效sgRNA解码算法，确保数据覆盖度和准确性。
3. 独家开发的AAV-scPerturb-seq平台，可实现对复杂活体组织的基因扰动分析，包括：脑组织、肿瘤微环境、肝脏心脏等器官；
4. 全转录组+调控网络+动态轨迹多维度数据深度的分析；
全球领先的体内Perturb-seq平台（AAV递送，支持复杂组织）
超低检测限（可分析<0.5%稀有细胞亚群）
AI增强分析（STAMP模型预测跨细胞系表型）
超高性价比（单细胞成本低至$0.001/细胞）
四、技术应用场景
1. 癌症研究：驱动基因功能注释（如KRAS/TP53突变连续表型谱）；耐药机制解析（筛选使奥希替尼敏感性提升的基因）；
2. 神经科学：疾病机制研究（如阿尔茨海默症风险基因的神经元特异性效应）； 脑细胞类型特异性扰动（AAV靶向神经元/胶质细胞）
3. 免疫治疗：CAR-T优化（筛选增强持久性的表观调控因子）； 自身免疫病靶点发现（如调节性T细胞功能相关基因）
4. 药物开发方面：脱靶效应预警（检测hERG通路异常激活）；联合用药策略（筛选协同致死基因组合）
五、实验参考周期
六、交付成果
6.1 原始数据（fastq）
6.2 分析报告：基础分析、高级分析
6.3 关键结果: 差异基因列表、调控网络图、细胞亚群注释
6.4 实验记录：详细protocol
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